懸浮細胞（如淋巴細胞、造血干細胞、腫瘤細胞系）因無貼壁依賴的生長特性，在體外培養(yǎng)中易受營養(yǎng)耗竭、代謝廢物堆積或環(huán)境應(yīng)激影響產(chǎn)生死細胞。死細胞釋放的核酸碎片、胞內(nèi)蛋白不僅污染培養(yǎng)體系，還會干擾細胞活性檢測、分選及功能實驗結(jié)果，甚至引發(fā)活細胞凋亡。因此，高效、低損傷地去除懸浮細胞中的死細胞，是細胞生物學(xué)研究、細胞治療及藥物研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文系統(tǒng)梳理主流去除技術(shù)的核心原理、操作要點與適用場景，為實驗設(shè)計提供科學(xué)參考。

一、密度梯度離心：基于密度差異的經(jīng)典分離法

密度梯度離心是利用活細胞與死細胞密度差異實現(xiàn)分離的傳統(tǒng)技術(shù)，核心邏輯是通過梯度介質(zhì)構(gòu)建密度梯度，使不同密度的細胞在離心力作用下遷移至對應(yīng)密度層，從而實現(xiàn)分離。其技術(shù)成熟度高、成本低，是大規(guī)模懸浮細胞純化的首選方案。

1. 核心原理與介質(zhì)選擇

活細胞因胞膜完整、胞質(zhì)成分均一，密度通常維持在 1.05~1.07 g/cm3；死細胞因胞膜破損、內(nèi)容物流失或吸水腫脹，密度降至 1.02~1.04 g/cm3，或因脫水皺縮密度異常升高。常用梯度介質(zhì)分為兩類：

Ficoll-Paque：密度固定為 1.077 g/cm3，滲透壓較高（約 340 mOsm/kg），適用于外周血單個核細胞（PBMC）、淋巴細胞等耐受度較高的細胞分離；

Percoll：可通過稀釋調(diào)節(jié)密度（1.000~1.130 g/cm3），滲透壓與細胞內(nèi)環(huán)境接近（280~320 mOsm/kg），更適合干細胞、敏感腫瘤細胞等脆弱細胞的純化。

2. 操作流程與關(guān)鍵控制

以 PBMC 分離為例，典型操作步驟為：將細胞懸液與 Ficoll-Paque 按 1:1 體積緩慢疊加（避免混合），室溫下以 400×g 離心 30 分鐘，離心后體系形成四層 —— 上層為血漿 / 培養(yǎng)基（含死細胞與細胞碎片），中層為 Ficoll-Paque，下層為紅細胞 / 粒細胞沉淀，活細胞則富集于中層與下層的界面。需注意：離心轉(zhuǎn)速不可超過 500×g（避免活細胞損傷），F(xiàn)icoll-Paque 分離后需用生理鹽水洗滌 2~3 次（去除殘留介質(zhì)，降低滲透壓損傷風(fēng)險）。

3. 優(yōu)勢與局限

該方法單次可處理 10?~10?個細胞，活細胞回收率達 80% 以上，適合大規(guī)模樣本的初步純化；但對密度接近活細胞的早期凋亡細胞分離效果有限，且 Ficoll-Paque 的高滲透壓可能導(dǎo)致敏感細胞活性下降。

二、免疫磁珠分選：基于表面標志物的特異性去除

免疫磁珠分選（MACS）利用死細胞表面特有的抗原標志物（如磷脂酰絲氨酸、壞死細胞特異性蛋白），通過抗體 - 磁珠復(fù)合物實現(xiàn)靶向捕獲，核心優(yōu)勢是特異性高（僅識別死細胞）、對活細胞損傷小（活性影響 < 5%），適用于高純度需求場景。

1. 靶點選擇與技術(shù)原理

最常用的靶點為磷脂酰絲氨酸（PS） —— 活細胞的 PS 僅分布于胞膜內(nèi)側(cè)，死細胞（尤其是早期凋亡細胞）因胞膜外翻使 PS 暴露于表面。將偶聯(lián)抗 PS 單克隆抗體的磁性微球（直徑 50~100 nm）與細胞懸液在 4℃孵育 15~20 分鐘，死細胞通過 PS 與抗體結(jié)合磁珠后，置于磁場中被吸附在管壁，活細胞隨上清液收集。此外，針對完全壞死的細胞，可選擇靶向 “壞死細胞特異性 DNA 片段” 或 “損傷胞膜蛋白” 的磁珠，進一步提升分離精度。

2. 操作要點與性能指標

孵育過程需嚴格控制溫度（4℃可減少非特異性結(jié)合），磁珠濃度需根據(jù)死細胞比例優(yōu)化（通常為 1×10?細胞加入 5 μL 磁珠），避免過量磁珠導(dǎo)致活細胞非特異性吸附。該技術(shù)可將死細胞比例從 30% 以上降至 5% 以下，活細胞增殖能力與功能不受影響，尤其適合 CAR-T 細胞制備、干細胞誘導(dǎo)分化等對細胞純度要求嚴苛的場景。

3. 優(yōu)勢與局限

特異性與低損傷性是其核心亮點，但單次處理細胞量通常不超過 10?個，且磁珠與抗體成本較高，更適合中小規(guī)模樣本的精細化純化。

三、過濾法與流式細胞術(shù)：從快速篩選到高精度分選

針對不同實驗需求，還可選擇基于物理特性的過濾法，或基于多參數(shù)的流式細胞術(shù)，實現(xiàn)死細胞的快速去除或高精度分選。

1. 過濾法：快速物理篩選

懸浮細胞中，死細胞因胞膜破損易發(fā)生腫脹（直徑增大 20%~30%）或皺縮（直徑減小 15%~20%），而活細胞大小均一（通常 10~20 μm）。利用孔徑 70~100 μm 的尼龍網(wǎng)或聚碳酸酯膜過濾，可攔截過大的腫脹死細胞與碎片；若需去除過小的皺縮死細胞，可采用 “兩步過濾法”—— 先通過 100 μm 篩網(wǎng)去除大雜質(zhì)，再通過 40 μm 篩網(wǎng)保留活細胞。該方法操作僅需 5~10 分鐘，無化學(xué)試劑干擾，適用于病毒感染后細胞樣本等緊急實驗的快速預(yù)處理，但特異性低，若活細胞與死細胞大小重疊（如小體積凋亡細胞），活細胞回收率僅 60%~70%，僅適合對純度要求不高的場景。

2. 流式細胞術(shù)：高精度多參數(shù)分選

流式細胞術(shù)（FCM）通過熒光染料區(qū)分活死細胞，實現(xiàn) “多參數(shù)篩選 + 單細胞分選”，是目前純度最高的去除技術(shù)（活細胞純度可達 99% 以上）。常用雙熒光標記策略：活細胞染料 Calcein-AM 進入細胞后被酯酶水解發(fā)出綠色熒光，死細胞染料 PI 僅穿透破損胞膜與 DNA 結(jié)合發(fā)出紅色熒光。儀器通過激光檢測熒光信號，僅收集 “Calcein-AM 陽性、PI 陰性” 的活細胞，同時可結(jié)合細胞大小、顆粒度等參數(shù)排除異常細胞。該方法適合稀有細胞（如循環(huán)腫瘤細胞、造血干細胞）的純化，但設(shè)備成本高（需流式分選儀）、處理量小（單次最大 10?個細胞），且激光照射可能輕微影響免疫細胞活化狀態(tài)，分選后需通過 CCK-8 法或功能實驗驗證活性。

四、技術(shù)選擇策略與關(guān)鍵注意事項

選擇死細胞去除技術(shù)時，需綜合三大核心因素：

細胞類型：脆弱細胞（如干細胞）優(yōu)先選 Percoll 密度梯度離心或免疫磁珠分選，耐受細胞（如 PBMC）可選 Ficoll-Paque；

樣本規(guī)模：大規(guī)模樣本（>10?個細胞）選密度梯度離心，中小規(guī)模高純度需求選免疫磁珠，稀有細胞選流式細胞術(shù)；

實驗成本：預(yù)算有限的常規(guī)實驗選過濾法或密度梯度離心，精細化研究或臨床應(yīng)用選免疫磁珠或流式。

此外，需注意三大操作要點：一是全程無菌操作，避免污染；二是處理前后用臺盼藍或熒光染料檢測死細胞比例，驗證去除效果；三是對純化后的活細胞進行活性驗證（如增殖實驗、功能檢測），確保技術(shù)過程未影響細胞功能。

總結(jié)

懸浮細胞死細胞去除技術(shù)已形成 “經(jīng)典方法 + 精準技術(shù)” 的多層次體系，從密度梯度離心的大規(guī)模分離，到免疫磁珠的特異性去除，再到流式細胞術(shù)的高精度分選，可滿足不同實驗場景需求。未來，隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，有望開發(fā)出 “高通量、低損傷、自動化” 的集成系統(tǒng)，進一步推動懸浮細胞在基礎(chǔ)研究（如細胞互作機制）與臨床應(yīng)用（如細胞治療）中的轉(zhuǎn)化落地。