類器官（Organoid）是由干細胞或組織碎片在體外三維培養(yǎng)條件下自組織形成的微型器官模型，能夠模擬體內(nèi)器官的結構和功能。其培養(yǎng)實驗流程涵蓋細胞獲取、三維培養(yǎng)體系構建、誘導分化、功能驗證及長期維護等關鍵步驟。以下是詳細的類器官培養(yǎng)實驗流程及注意事項：
一、實驗前準備
1.材料與試劑
細胞來源：成體干細胞（如腸道隱窩干細胞、肝祖細胞）、誘導多能干細胞（iPSCs）或胚胎干細胞（ESCs）。
培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基（如Advanced DMEM/F12）補充生長因子（EGF、Noggin、R-spondin1等）、抗生素（青霉素/鏈霉素）、谷氨酰胺及B27補充劑。
基質(zhì)膠：Matrigel或人工合成水凝膠（如Geltrex），用于提供三維支撐。
其他試劑：膠原酶、Dispase、TrypLE（細胞消化液）、PBS、4%多聚甲醛（固定液）。
2.設備與耗材
細胞培養(yǎng)箱（37℃、5% CO?）、低溫離心機、顯微鏡、移液器、24孔/48孔培養(yǎng)板、無菌操作臺。
二、類器官培養(yǎng)實驗流程
1. 細胞獲取與分離
成體干細胞分離（以腸道類器官為例）：
組織處理：取小鼠或人腸道組織，用PBS沖洗后剪碎，加入膠原酶（2 mg/mL）或Dispase（1 U/mL）37℃消化30-60分鐘，直至形成單細胞懸液。
隱窩分離：通過密度梯度離心或過濾（70 μm濾網(wǎng)）分離腸道隱窩，隱窩是類器官形成的起始單位。
iPSCs/ESCs分離：
從已建立的干細胞系中消化獲取單細胞，懸浮培養(yǎng)形成胚胎體（Embryoid Bodies, EBs），再誘導分化為特定譜系細胞。
2. 三維基質(zhì)膠包被
基質(zhì)膠準備：將Matrigel于4℃解凍，按1:10比例與預冷的基礎培養(yǎng)基混合（避免氣泡產(chǎn)生）。
包被培養(yǎng)板：每孔加入50-100 μL基質(zhì)膠混合液，37℃孵育30分鐘使其凝固，形成三維支撐結構。
3. 類器官接種與初始培養(yǎng)
細胞接種：將分離的隱窩或干細胞（500-1000個/孔）懸浮于50 μL培養(yǎng)基中，均勻滴加至基質(zhì)膠表面，37℃靜置15分鐘使細胞沉降。
覆蓋培養(yǎng)基：輕柔加入預熱的完全培養(yǎng)基（500 μL/孔），避免沖散細胞。
4. 誘導分化與培養(yǎng)基更換
分化條件：根據(jù)器官類型調(diào)整培養(yǎng)基成分：
腸道類器官：補充EGF（50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、R-spondin1（500 ng/mL）促進隱窩增殖。
肝類器官：添加HGF（20 ng/mL）、Oncostatin M（10 ng/mL）誘導肝芽形成。
腦類器官：使用無血清培養(yǎng)基（Neurobasal）補充FGF2、BDNF，促進神經(jīng)分化。
培養(yǎng)基更換：每3-4天半量更換培養(yǎng)基，避免類器官脫離基質(zhì)膠。
5. 類器官擴增與傳代
傳代時機：當類器官直徑達200-500 μm時（約7-14天），需進行傳代以維持活性。
傳代步驟：
吸除舊培養(yǎng)基，用冷PBS沖洗2次。
加入基質(zhì)膠消化液（如Dispase，2 mg/mL）37℃孵育20-30分鐘，直至基質(zhì)膠溶解。
收集類器官至15 mL離心管，500×g離心5分鐘，棄上清。
用TrypLE或Accutase于37℃消化5-10分鐘，形成單細胞或小團塊。
離心后重懸于新鮮基質(zhì)膠中，按1:3比例傳代至新培養(yǎng)板。
6. 功能驗證與檢測
形態(tài)學觀察：顯微鏡下記錄類器官生長情況（如腸道類器官的囊狀結構、肝類器官的膽汁管形成）。
免疫熒光染色：檢測器官特異性標記物（如腸道類器官的LGR5、肝類器官的HNF4α）。
功能分析：
腸道類器官：檢測刷狀緣酶活性（如堿性磷酸酶）。
肝類器官：測定白蛋白分泌量或尿素合成能力。
腦類器官：評估電生理活性（如鈣成像）或神經(jīng)元突觸形成。
三、關鍵注意事項
1.無菌操作：全程在無菌操作臺中進行，避免細菌/真菌污染。
2.基質(zhì)膠質(zhì)量：使用低生長因子基質(zhì)膠，避免干擾類器官分化。
3.溫度控制：基質(zhì)膠需4℃保存，解凍后分裝使用，防止反復凍融。
4.細胞密度：接種密度過高會導致營養(yǎng)競爭，過低則難以形成類器官。
5.分化因子濃度：需根據(jù)類器官類型優(yōu)化生長因子組合（如Wnt通路激活劑對腸道類器官至關重要）。
四、應用場景
疾病模型：構建腫瘤類器官（如結直腸癌、胰腺癌）用于藥物篩選。
再生醫(yī)學：研究肝、腎類器官的移植潛力。
發(fā)育生物學：解析器官發(fā)生機制（如腦類器官模擬皮質(zhì)層形成）。
毒理學測試：評估化學物質(zhì)對器官的毒性效應。
五、常見問題與解決方案
類器官不形成：檢查基質(zhì)膠是否凝固完全，或調(diào)整細胞接種密度。
生長緩慢：補充生長因子或更換新鮮培養(yǎng)基。
污染：立即丟棄污染培養(yǎng)物，徹底消毒操作臺。
傳代后死亡：優(yōu)化消化時間，避免過度機械損傷。
通過規(guī)范化的實驗流程與嚴格的質(zhì)量控制，類器官培養(yǎng)可高效模擬體內(nèi)器官的生理與病理狀態(tài)，為生物醫(yī)學研究提供強大的體外模型。
